Zaměření laboratoře biologie pylu
Laboratoř biologie pylu ÚEB AV ČR se zabývá výzkumem regulačních mechanismů zajišťujících správný průběh vývoje a zrání samčího gametofytu, pylu a pylových láček. Modelovými systémy jsou pyl a pylové láčky Arabidopsis thaliana a tabáku, na kterých jsou studovány dvě hlavní hladiny regulace genové exprese, regulaci transkripce a translace.
Řešená témata
Na transkripční úrovni hledáme transkripční faktory aktivní v různých fázích vývoje pylu Arabidopsis a ověřujeme jejich regulační funkci. Dále nás zajímají regulační sekvence v promotorech gametofytických genů, které se spolu se zkoumanými transkripčními faktory na kontrole genové exprese podílejí.

Translační úroveň představuje studium mechanismu skladování mRNA během zrání pylu a její kontrolované aktivace po vyklíčení pylového zrna. To zahrnuje zejména studium EPP částic, keré se podílejí jak na skladování mRNA tak na její následné translaci a dokonce na úpravách a lokalizaci de novo syntetizovaných bílkovin. Konečně nás zajímá vztah cytoskeletu a regulace translace.

V neposlední řadě se zabýváme pylovou proteomikou, konkrétně změnami na úrovni proteomu a jeho subfrakcí (fosfoproteom, stěnový proteom, membránový proteom) během vývoje a zrání pylu a v roztoucích pylových láčkách.

Detailní informace o fyziologii samčího gametofytu naleznete v anglické verzi www stránek laboratoře.
Nejdůležitější výsledky
Objev a charakterizace EPP částic
Během progamické fáze vývoje samčího gametofytu se rychle aktivují syntetické a katabolické procesy potřebné pro explozivní růst pylové láčky. Je dobře dokumentováno, že během zrání pylu hrají pří specifikaci genové exprese klíčovou roli procesy transkripce i translace. Naopak, u mnoha druhů bylo prokázáno, že klíčení pylu je do značné míry nezávislé na transkripci, ale životně závislé na translaci skladovaných mRNA. Publikovali jsme první strukturní a proteomická data o velkých ribonucleoproteinových částicích (EPPs) v samčím gametofytu tabáku (Honys et al. 2009). Tyto komplexy jsou tvořeny v nezralém pylu, kde obsahují translačně neaktivní mRNA. Přestože jsou masivně aktivovány bezprostředně po vyklíčení pylu, slouží také jako dlouhodobá zásoba transkriptů, které jsou v této formě přepravovány společně s celým translačním aparátem do oblasti špičky rostoucí pylové láčky. Bylo prokázáno, že EPP komplexy obsahují ribozomální podjednotky, ribosomální RNA a soubor mRNA. Zatímní výsledky vedly k rozšíření našeho pohledu na EPP částice z pouhého kompartmentu pro skladování mRNA na komplexní a dobře organizovanou mašinérii, jejímiž úkoly jsou skladování mRNA, její přeprava a následná řízená aktivace zahrnující syntézu bílkovin a dokonce i jejich úpravy a přesnou lokalizaci. Popsaná strukturní organizace je velmi užitečná právě v rychle rostoucích pylových láčkách. Při jejich vrcholovém růstu se syntéza bílkovin, jejich následné zpracování a doprava musí odehrávat v přesně lokalizovaných oblastech. Přítomnost převážné většiny nejbližších ortologů bílkovin tvořících EPP také v pylu Arabidopsis také naznačuje, že komplexní úloha EPP částic nemusí být omezena pouze na tabák, ale popsaný koncept spíše představuje obecný fenomén.

Úloha transkripčních faktorů rodiny bZIP ve vývoji pylu
Pohlavní rozmnožování rostlin je podmíněno produkcí a diferenciací funkčních gamet, k němuž dochází během vývoje haploidní generace, gametofytu. V současné době máme jen omezené znalosti regulačních mechanismů, které se vyvinuly k iniciaci a kontrole gametofytického vývojového programu. Chceme-li takové mechanismy popsat, musíme nalézt transkripční faktory (TF), které jsou součástí těchto regulačních sítí. My jsme se zaměřili na transkripční faktory rodiny bZIP, které hrají důležitou úlohu v kontrole vývojových procesů u rostlin i živočichů. Provedli jsme funkční charakterizaci faktoru AtbZIP34 u Arabidopsis thaliana. Gen AtbZIP34 je aktivní v gametofytických i okolních sporofytických pletivech během vývoje květu (Gibalová et al. 2009). Přítomnost inzerce T-DNA v genu AtbZIP34 má za následek dramatické vývojové a morfologické defekty, a vede ke snížené klíčivosti pylu a k pomalejšímu růstu pylových láček in vitro i in vivo. Světelná i fluorescenční mikroskopie odhalila v mutantním pylu deformovaná buněčná jádra a v cytoplazmě přítomnost velkých lipidových inkluzí. Skenovací a transmisní elektronová mikroskopie navíc ukázala defekty fomování exiny a intiny stejně jako redukovaný endomembránový systém. Vše ukazuje na to, že AtbZIP34 hrahe důležitou a komplexní úlohu během vývoje gametofytu, a to jak na úrovni sporofytu tak gametofytu. Je tak prvním transkripčním faktorem, u něhož byla taková obojetná úloha potvrzena.

Databáze aGFP
Čipová technologie patřící ke standardním nástrojům funkční genomiky v posledních letech prodělala masivní rozvoj, což mimo jiné vedlo ke zvýšené přesnosti a spolehlivosti transkriptomických dat. Počet experimentů využívajících čipovou technologii se v posledních letech dramaticky zvýšil. Souběžně s rychlou akumulací transkriptomických dat se objevují nejrůznější on-line nástroje pro jejich analýzu a interpretaci. My jsme vytvořili spravovanou databázi transkriptomických dat nazvanou Arabidopsis Gene Family Profiler (aGFP; http:// agfp.ueb.cas.cz). tato databáze umožňuje uživateli přístup k velké kolekci normalizovaných transkriptomických dat pořízených na platformě Affymetrix ATH1 Microarray (Dupľáková et al. 2007). Databáze nyní obsahuje data z různých pletiv a orgánů v různých vývojových stádiích divokého typu rostlin Arabidopsis získaná z téměř 350 genových čipů. Při tvorbě databáze byl kladen důraz na snadné ovládání a uživatelsky přívětivé grafické pracovní rozhraní. Databáze byla koncipována jako nástroj pro uživatele, kteří potřebují snadno dostupný zdroj informací o expresních profilech jednoho nebo více genů či jejich rodin s další možností vyhledávání podle klíčových slov. Mezi charakteristické rysy arabidopsisGFP patří: 1) způsob prezentace normalizovaných dat, 2) výběr mezi dvěma různými normalizačními algoritmy (Affymetrix MAS4 nebo MAS5), 3) intuitivní rozhraní, a konečně 4) interaktivní "virtuální rostlina", která vizualizuje expresi příslušných genů a genových rodin.

Vývojová pylová transkriptomika
Funkční specializace samčího gametofytu je považována za klíčový faktor evolučního úspěchu semenných rostlin. Pylová ontogeneze navíc představuje atraktivní modelstudia buněčných sítě, kontroly buněčného růstu, asymetrického buněčného dělení a buněčné diferenciace. Naším cílem a také nezbytným krokem pro detailní porozumění těmto procesům, bylo komplexně popsat samčí haploidní transkriptom a dynamiku jeho změn během vývoje pylu (Honys a Twell 2003, 2004). Vyvinuli jsme specifický postup isolace čtyř vývojových stádií pylu Arabidopsis. Použití DNA čipu Affymetrix ATH1 pak vedlo k popsání celkem 13.977 transkriptů přítomných v samčím gametofytu, z nichž přibližně 9,7% vykazovalo specifický expresní profil. Přechod z dvoubuněčného k trojbuněčnému pylu byl provázen poklesem počtu různých transkriptů a ke zvýšení podílu specifických genů. Na základě expresních profilů regulačních bílkovin a s nimi koexprimovaných genů vedlo k identifikaci genů, které by mohly být součástí specifických gametofytických regulačních sítí. Popsané výsledky navíc přestavovaly vůbec první transkriptomická data charakterizující dynamiku změn transkriptomu během vývoje efektivně jediné rostlinné buňky.
Mezinárodní spolupráce
Prof. David Twell lab, Dept. of Botany, University of Leicester, Leicester, UK;
http://www.le.ac.uk/bl/research/pollen/pollen.html

Dr. Hans-Peter Mock lab, Dept. of Applied Biochemistry, IPK Gatersleben, Germany;
http://www.ipk-gatersleben.de/Internet/Forschung/PhysiologieZellbiologie/Biochemie

Prof. Heven Sze lab, Cell Biology & Molecular Genetics, University of Maryland, College Park, MD, USA;
http://cbmg.umd.edu/

Prof. Jiří Friml lab, VIB Department of Plant Systems Biology, Ghent University, Belgium;
http://www.psb.ugent.be/auxin-projects